Резюме. В качестве источника грибковых инфекций у морских черепах описаны различные дрожжевые и нитчатые грибки. Среди них Fusarium solani вызывает кожные инфекции, поражая ослабленных взрослых животных (выловленных из природных вод) и контаминирует гнезда, в результате чего вид несет огромные потери во время размножения. Наглядно представлена патогенность грибка на примере нашего опыта во время разведения головастых черепах (Caretta caretta), впервые полученных в морском парке Marineland в Антибе в 2010 году и снова получивших приплоды в 2011 и 2013 годах.

У 6 выживших особей (0,9% яиц) первого поколения развились поражения кожи, а также мультифокальные поражения внутренних органов. Микробиологическое исследование образцов позволило установить в качестве этиологического агента F.solani. Противогрибковая терапия позаконазолом спасла 2 особей из 6 (выживаемость 33%). Эпизоотологические исследования, контроль, строгие меры гигиены, создание ранних диагностических критериев и протоколов профилактики и лечения помогали нам предотвращать и более эффективно лечить от инфекции последующие выводки в 2011 и 2013 году (80 особей в общей сложности - 6,6% от кладки), подняв коэффициент выживаемости до 50%. F.solani выступает в качестве основной угрозы для репродукции морских черепах в дикой природе. Отметим, что эта проблема также представляет угрозу для разведения. Факторы передачи и патогенность Fusarium spp. для головастых черепах освещены в данных литературы о взрослых морских черепахах и их гнездах в природе, а также в данных нашего разведения.

Введение

Шесть видов морских черепах, в том числе Caretta caretta, обитающие в Средиземном море и находящиеся под угрозой исчезновения, вероятно, могут поражаться различными поверхностными или глубокими микозами. Среди различных возбудителей основное место занимает Fusarium solani [1,2]. Он вызывает поверхностные и системные поражения у свободноживущих и выловленных для реабилитации взрослых особей, а также поражает гнезда в дикой природе, результатом чего являются массовые потери при размножении. Первые упоминания о возбудителе у черепах датируются 1981 годом у C.caretta на Багамских островах [3], после чего подобные сообщения стали регулярными, например, последнее сообщение Sarmiento-Ramirez et al., 2014 [2]. О черепахах с поражениями кожи и панциря [4,5], а также легких [6] время от времени сообщалось с 1997 года. Мы сообщаем в этой работе о патогенности F.solani в отношении молодых особей C.caretta, полученных первый раз в неволе в 2010 году в морском парке Marineland в Антибе.

Исследование

В морском парке Marineland в Антибе содержат черепах C.caretta. В 2010 году регулярное УЗИ этих черепах позволило определить беременность у 2 самок возрастом несколько старше 50 лет. Не смотря на наличие песчаного пляжа в их бассейнах, позволяющего совершить кладку в обстановке, приближенной к естественной, яйца были отложены прямо в воде. Все яйца были собраны, очищены, продезинфицированы хлоргексидином и перенесены на инкубацию в питомник, где за ними осуществлялся постоянный контроль: дезинфекция воздуха и поверхностей, контроль температуры и влажности, а также соблюдение гигиены персоналом при работе. Из 622 яиц собрали все яйца, выглядевшие неповрежденными, 20 оказались оплодотворены и из 6 (0,9%) вылупились молодые черепахи. В течение 8 недель после вылупления снижение аппетита и заметное замедление роста вызвали подозрения об инфекции, подтверждающиеся появлением обширных белесых пушистых очагов на покровах, указывающих на грибковое заболевание (Фото 1 и 2). Несмотря на попытки терапии с применением различных антибиотиков системно и энилконазола местно (раствор 2 мг/мл, 3 раза в день, курсами различной длительности - до 35 дней), 4 черепахи погибли. Вскрытие показало наличие множественных абсцессов в коже, полости рта, легких, печени, сердце и в самом целоме (Фото 3). Во время вскрытия у двух из четырех погибших черепах были взяты образцы для микробиологического исследования. Исследование мазков, окрашенных по Май-Грюнвальду-Гимзе, помогло определить нити мицелия, напоминающие макроконидии Fusarium sp. (Фото 4). Культуральный посев на среде Сабуро с добавлением хлорамфеникола (BBLTM Sabouraud, Becton Dickinson) после инкубации при темературе 30 и 37 градусов по Цельсию позволил за 7 дней получить многочисленные изолированные колонии Fusarium sp., позже идентифицированные, как F.solani при помощи технологии MALDI-TOF [7]. Для подтверждения участия Fusarium sp. в роли возбудителя было проведено лечение в виде подачи позаконазола в дозе 0,02 мг/100 г, 1 раз в день, что позволило спасти оставшихся двух молодых черепах (33%). Выбор терапии был основан на данных посева с определением чувствительности и доступности препарата в подходящей для этих животных лекарственной форме.





Экологическое исследование с повторными микробиологическими тестами образцов воды, воздуха и различных поверхностей в питомнике не смогли помочь определить источник заражения. В ходе проверок места, где проходила инкубация яиц, уязвимостей не было найдено, но гигиенические меры были усилены. Две другие кладки, полученные в 2011 и 2013 годах, имели такое же количество яиц и приплод составил около 80 штук (выживаемость: 3,3%). У большинства из них в скором времени заподозрили фузариоз на основании данных клинического исследования и/или данных компьютерной томографии (Фото 5). Всем животным сразу прописали позаконазол в дозе, указанной выше. Продолжительность лечения составляла в среднем 1 месяц (в некоторых случаях от 15 дней до 3 месяцев). Благодаря этому летальность составила 50%. Из 40 выживших черепах ни у кого не наблюдалось рецидивов и не требовалось терапевтическое лечение в течение 12 месяцев наблюдения, даже если сканирование указывало на наличие остаточных абсцессов. Эти молодые C.caretta в скором времени были переданы другим морским паркам, участвующим в сохранении видов, находящихся под угрозой исчезновения.

Обсуждение

Наши данные, касающиеся ювенильных особей, вылупившихся и выращенных в неволе, дополняют два случая, описанные ранее в литературе (заболевание взрослых особей и поражение кладок в дикой природе). Заболеваниям, вызванным Fusarium spp., у морских черепах могут способствовать три фактора: контаминация окружающей среды, патогенность отдельных штаммов и, наконец, некоторая иммуносупрессия этих животных, повышающая их восприимчивость к этой инфекции.

Fusarium spp. являются повсеместно распространенными грибками-сапрофитами и фитопатогенами. Нередко эти грибки поражают человека, вызывая онхомикоз или, реже, более глубокие поражения [8]. Он не является частью нормальной микрофлоры у морских животных [9,10] и был описан в качестве возбудителя инфекции у многих других пресноводных (пресноводных черепах [11], аллигаторов [12]) или морских (дельфины [10,13,14], ластоногие [10,15], костные рыбы [16,17], акулы [18,19]) животных. В ходе исследования окружающей среды в японском морском парке, похожем на парк Marineland, в котором морские млекопитающие страдали от грибковой инфекции, Fusarium spp. был выделен из образцов, взятых из бассейнов для содержания [20]. Работа Sarmiento-Ramirez et al. с выводком C.caretta в морском заповеднике в Кабо-Верде также показала, что F.solani присутствовал в песчаных гнездах и очень хорошо рос в этих условиях [1,2]. В том случае были инфицированы только те яйца, которые контактировали с песком (крайние в кладке), что позволяет предположить, что источником заражения был именно песок, а не беременные самки [1]. Различные молекулярные исследования подтверждают идентичность штаммов, изолированных из окружающей среды, и штаммов, ответственных за заболевания взрослых черепах и поражения их гнезд [1,9]. С другой стороны, наличие аналогичных штаммов в песке из пораженных и невредимых гнезд привело Сармьенто-Рамиреса с коллегами к предположениям, какие еще факторы, помимо штамма грибка, могут влиять на развитие инфекции: микроклимат гнезда, состав песка и наличие в нем токсинов, вероятность затопления во время прилива, наличие ила [1,2]. В нашем же случае об источнике инфекции можно только догадываться. Мне не нашли возбудителя в окружающей среде, но, возможно, наличие грибков в окружающей среде является непостоянным и, следовательно, при поиске это вызывает проблемы. Это также предположил Montali с соавторами, описывая кожные повреждения, вызванные Fusarium sp., которые исчезали и возникали вновь у содержащихся в неволе ластоногих, что связано с цикличной распространенностью Fusarium sp., зависящую от колебаний температуры воды и степени ее хлорирования [15]. У молодняка нашего разведения развивалась инфекция, в то время как на оболочках яиц и у зародышей не наблюдалось макроскопических признаков инфекции, что указывает на контаминацию воды после вылупления. Контаминация, однако, может произойти и до вылупления, но оно предупреждается гигиеной и постоянным контролем в питомнике, более низкой плотностью концентрации особей в местах природных кладок или неволи, где концентрация особей в популяции ниже, чем в случае сообщения о фузариозе [21-26]. Сармьенто-Рамирес с коллегами в ходе исследования на черепашьих яйцах показали вирулентность штаммов, изолированных с гнезд C.caretta в Кабо-Верде [1]. В более поздней работе они указали на то, что возникновение заболевания связано с F.keratoplasticum и F.falciforme, а также, собственно, с подвидами F.solani [2]. Сейчас сообщения о штаммах, приспособившихся к водной среде, с одинаковой частотой встречаются и в медицинских трудах, и в работах по ветеринарии [16,27]. Эти наблюдения совпадают с результатами проведенных ранее исследований, также показавших способность Fusarium spp. существовать в воде [28]. Так, работа Sautour с коллегами от 2012 года показала, что некоторые популяции Fusarium spp., адаптированные к росту в водной среде, оказались устойчивы к различным химическим веществам, применяемым для очистки воды (например, к хлору), что позволяло им колонизировать госпитальные сети водоснабжения [27]. В довесок ко всему, уже известная кератинолитическая способность Fusarium spp. [29], является еще одним фактором патогенности, особенно для черепах с их особенностями [23,24,30]. Одним из предрасполагающих факторов к заболеваниям грибковой, бактериальной и вирусной природы считается охлаждение воды (сезонное или в связи с течениями), которое вынуждает морских черепах перебираться на мелководье [31], где их поимка наиболее легка и нередка, стресс от которой усугубляет ситуацию ослаблением иммунной системы, и без того расшатанную похолоданием [4,5]. Кроме всего прочего, всегда есть вероятность и врожденного иммунодефицита, упомянутого Manire с коллегами в 2002 году в описании случая заражения черепах грибком Colletotrichum acutatum [31]. Предположение о врожденной предрасположенности в некоторой степени объясняет в гнездах, колонизированных F.solani, как наличие заболевания, так и его отсутствие [ 1,2]. Условия для возникновения оппортунистической инфекции не отличаются от таковых у других животных; ворота инфекции могут появляться, например, на месте травмы, как это описано Cabanes с коллегами в 2012 году и Williams с коллегами в 1997 году [4,5]. Так же, как и у людей, ворота инфекции могут появиться на месте повреждения кожи (ожоги, глубокие дерматомикозы, даже постановка катетера) [8]. В легочной форме, а также в проникающих в прочие органы формах ворота инфекции остаются невыясненными точно, но вполне может быть, что легочной формой фузариоза животные заражаются, собственно, путем респираторной передачи [6]. Во всех этих случаях, в нашем в том числе, был необходим комплексный подход и после первой вспышки заболевания были предложены превентивные гигиенические меры. Они включали в себя:

  1. Клиническое обследование (под особый контроль попадали особи со сниженным аппетитом и внешними поражениями);
  2. Использование КТ для установления внутренних поражений, их локализации, а также для отслеживания их развития;
  3. Незамедлительное использование позаконазола по прописи, освещенной выше, во время болезни и дополнительно в течение 14 дней после исчезновения клинических признаков (восстановление аппетита и исчезновение поражений кожного покрова). Использование такого подхода позволило значительно снизить летальность во втором и третьем выводках.

По большому счету, Fusarium spp. может фигурировать в качестве возбудителя заболевания у морских черепах всех видов и во всех районах, где происходит их размножение [2], в том числе и в питомниках. Возникновению инфекции способствует множество факторов, от экологии и патогенности штамма грибка до состояния иммунитета животных. Наш первый опыт с C.caretta заставил нас установить систему профилактических мер, согласно которой мы действовали в двух последующих случаях и добились значительного снижения смертности и передали выращенных животных в другие парки, участвующие в программах по сохранению вымирающих видов животных.

Конфликт интересов

Авторы указывают об отсутствии связей с заинтересованными лицами и организациями.

Благодарность

Мы выражаем благодарность команде врачей и ученых центра исследований в Marineland, фонд Marineland за их преданность общему делу и их участие в программе по сохранению морских черепах C.caretta, а также управление и администрацию центра за их поддержку. Мы благодарим медицинский центр при институте биологии в Антибе за их помощь в виде исследований на их оборудовании.

Garcia-Hartmann3, C. Hennequinb, S. Catteauc C. Beatinid, V. Blanc d’*

aCentre de recherche pour la conservation, Marineland, 306, avenue Mozart, 06600 Antibes, France

b Service de parasitologie-mycologie, hbpital Saint-Antoine, 184, rue du Faubourg-Saint-Antoine, 75571 Paris cede* 12, France

c Fondation Marineland, 306, avenue Mozart, 06600 Antibes, France

dService ae biologie, centre hospitalier d’Antibes, 107, avenue de Nice, 06600 Antibes, France

Перевод с французского: Куторов С.А., ветеринарный врач, Новосибирск.

Список литературы

  • Sarmiento-Ramirez JM, Abella E, Martin MP, Telleria MT, Lopez-Jurado LF, Marco A, et al. Fusarium solani is responsible for mass mortalities in nests of loggerhead sea turtle, Caretta caretta, in Boavista, Cape Verde. FEMS Microbiol Lett 2010; 312:192—200.
  • Sarmiento-Ramirez JM, Abella-Perez E, Phillott AD, Sim J, van West P, Martin MP, et al. Global distribution of two fungal pathogens threatening endangered sea turtles. PLoS One 2014;9:e85853.
  • Rebell G. Fusarium in human and veterinary medicine. In: Nelson PE, Toussoun TA, Cook RJ, editors. Fusarium: diseases biology and taxonomy. University park, PA: The Pennsylvannia State University Press; 1981. p. 210—20.
  • Cabanes FJ, Alonso JM, Castella G, Alegre F, Domingo M, Pont S. Cutaneous hyalohyphomycosis caused by Fusarium solani in a loggerhead sea turtle (Caretta caretta L.). J Clin Microbiol 1997;35:3343—5.
  • Williams SR, Sims MA, Roth-Johnson L, Wickes B. Surgical removal of an abscess associated with Fusarium solani from a Kemp's ridley sea turtle (Lepidochelys kempii). J Zoo Wildl Med 2012;43:402—6.
  • Oros J, Delgado C, Fernandez L, Jensen HE. Pulmonary hyalo-hyphomycosis caused by Fusarium spp. in a Kemp's ridley sea turtle (Lepidochelys kempi): an immunohistochemical study. N Z Vet J 2004;52:150—2.
  • Marinach-Patrice C, Lethuillier A, Marly A, Brossas JY, Gene J, Symoens F, et al. Use of mass spectrometry to identify clinical Fusarium isolates. Clin Microbiol Infect 2009;15:634—42.
  • Dignani MC, Anaissie E. Human fusariosis. Clin Microbiol Infect 2004;10:67—75.
  • Castella G, Cano J, Guarro J, Cabanes FJ. DNA fingerprinting of Fusarium solani isolates related to a cutaneous infection in a sea turtle. Med Mycol 1999;37:223—6.
  • Frasca Jr S, Dunn JL, Cooke JC, Buck JD. Mycotic dermatitis in an Atlantic white-sided dolphin, a pygmy sperm whale, and two harbor seals. J Am Vet Med Assoc 1996;208:727—9.
  • Jacobson ER, Calderwood MB, Clubb SL. Mucormycosis in hatchling Florida soft-shell turtles. J Am Vet Med Assoc 1980;177:835—7.
  • Frelier PF, Sigler L, Nelson PE. Mycotic pneumonia caused by Fusarium moniliforme in an alligator. Sabouraudia 1985;23: 399—402.
  • Tanaka M, Izawa T, Kuwamura M, Nakao T, Maezono Y, Ito S, et al. Deep granulomatous dermatitis of the fin caused by Fusarium solani in a false killer whale (Pseudorca crassidens). J Vet Med Sci 2012;74:779—82.
  • Staggs L, St Leger J, Bossart G, Townsend Jr FI, Hicks C, Rinaldi M. A novel case of Fusarium oxysporum infection in an Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). J Zoo Wildl Med 2010;41:287—90.
  • Montali RJ, Bush M, Strandberg JD, Janssen DL, Boness DJ, Whitla JC. Cyclic dermatitis associated with Fusarium sp. infection in pinnipeds. J Am Vet Med Assoc 1981;179: 1198—202.
  • Hatai K, Kubota SS, Kida N, Udagawa S. Fusarium oxysporum in red sea bream (Pagrus sp.). J Wildl Dis 1986;22:570—1.
  • Ostland VE, Ferguson HW, Armstrong RD, Asselin A, Hall R. Granulomatous peritonitis in fish associated with Fusarium solani. Vet Rec 1987;121:595—6.
  • Crow GL, Brock JA, Kaiser S. Fusarium solani fungal infection of the lateral line canal system in captive scalloped hammerhead sharks (Sphyrna lewini) in Hawaii. J Wildl Dis 1995; 31:562—5.
  • Smith AG, Muhvich AG, Muhvich KH, Wood C. Fatal Fusarium solani in baby sharks. J Med Vet Mycol 1989;27:83—91.
  • Kohata E, Kano R, Akune Y, Ohno Y, Soichi M, Yanai T, et al. Environmental isolates of fungi from aquarium pools housing killer whales (Orcinus orca). Mycopathologia 2013;176: 403—8.
  • Creeper JH, Main DC, Berger L, Huntress S, Boardman W. An outbreak of mucormycosis in slender tree frogs (Litoria adelensis) and white-lipped tree frogs (Litoria infrafrenata). Aust Vet J 1998;76:761 —2.
  • Khoa LV, Hatai K, Aoki T. Fusarium incarnatum isolated from black tiger shrimp, Penaeus monodon Fabricius, with black gill disease cultured in Vietnam. J Fish Dis 2004;27:507—15.
  • Nardoni S, Lungonelli P, Papini R, Mugnaini L, Mancianti F. Shell mycosis in a group of Hermann's tortoises (Testudo hermanni). Vet Rec 2012;170:76.
  • Rose FL, Koke J, Koehn R, Smith D. Identi fication of the etiological agent for necrotizing scute disease in the Texas tortoise. J Wildl Dis 2001;37:223—8.
  • Perpinan D, Trupkiewicz JG, Armbrust AL, Geiser DM, Armstrong S, Garner MM, et al.
  • Dermatitis in captive Wyoming toads (Bufo baxteri) associated with Fusarium spp.. J Wildl Dis 2010;46:1185—95.
  • Salter CE, O'Donnell K, Sutton DA, Marancik DP, Knowles S, Clauss TM, et al. Dermatitis and systemic mycosis in lined seahorses Hippocampus erectus associated with a marine-adapted Fusarium solani species complex pathogen. Dis Aquat Organ 2012;101:23 —31.
  • Sautour M, Edel-Hermann V, Steinberg C, Sixt N, Laurent J, Dalle F, et al. Fusarium species recovered from the water distribution system of a French university hospital. Int J Hyg Environ Health 2012;215:286—92.
  • Wadhwani K, Srivastava AK. Fungi from otitis media of agri-cultural field workers. Mycopathologia 1984;88:155—9.
  • Galletti J, Negri M, Grassi FL, Kioshima-Cotica ES, Svidzinski TI. Fusarium spp. is able to grow and invade healthy human nails as a single source of nutrients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2015;34(9):1767-72 [Epub ahead of print].
  • Oros J, Calabuig P, Arencibia A, Camacho M, Jensen H. Systemic mycosis caused by Trichophyton spp. in an olive ridley sea turtle (Lepidochelys olivacea): an immunohistochemic al study. N Z Vet J 2011;59:92—5.
  • Manire CA, Rhinehart HL, Sutton DA, Thompson EH, Rinaldi MG, Buck JD, et al. Disseminated mycotic infection caused by Colletotrichum acutatum in a Kemp's ridley sea turtle (Lepidochelys kempi). J Clin Microbiol 2002;40:4273—80.